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熒光定量技術(shù)通過(guò)特異性熒光染料與靶蛋白的結(jié)合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)定量，其靈敏度和選擇性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光計(jì)作為一款緊湊型檢測(cè)設(shè)備，采用特異性熒光探針技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)微量核酸與蛋白質(zhì)的快速定量，其核心優(yōu)勢(shì)包括樣品消耗量少、檢測(cè)速度快及抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)。

一、 材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、儀器：博清生物熒光計(jì)；對(duì)照熒光計(jì)；紫外分光光度計(jì)；電子天平；微量移液器。

2、試劑：熒光標(biāo)記蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（FITC-BSA，分子量66 kDa，純度≥98%）；熒光標(biāo)記蛋白檢測(cè)試劑盒；BSA標(biāo)準(zhǔn)品；常見干擾物（NaCl、SDS、Triton X-100、游離FITC染料）。

3、耗材：低吸附離心管（1.5mL）；無(wú)菌無(wú)酶吸頭（0.1~10μL、10~100μL、100~1000μL）；儀器配套比色皿。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精確稱量FITC-BSA標(biāo)準(zhǔn)品，用PBS緩沖液（pH7.4）配制濃度為1mg/mL的儲(chǔ)備液，梯度稀釋為0.05、0.1、1、10、50、100、200ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按照博清生物熒光計(jì)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，取1μL標(biāo)準(zhǔn)溶液與199μL工作液（染料與緩沖液按1:200比例混合）充分混勻，室溫避光孵育3分鐘后，插入儀器檢測(cè)倉(cāng)進(jìn)行熒光信號(hào)讀取。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)熒光單位（RFU）為縱坐標(biāo)，采用二次曲線擬合建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2）。

2、方法學(xué)驗(yàn)證

線性范圍與檢出限：對(duì)0.05~200ng/μL的FITC-BSA標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行樣，以R2≥0.995的濃度范圍為有效線性范圍；以3倍空白信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差（3SD）對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限（LOD），10倍空白信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差（10SD）對(duì)應(yīng)的濃度為定量限（LOQ）。

精密度：選取低（1ng/μL）、中（50ng/μL）、高（150ng/μL）三個(gè)濃度的FITC-BSA樣品，每個(gè)濃度設(shè)置8個(gè)平行樣，進(jìn)行單次批內(nèi)檢測(cè)；連續(xù)5天進(jìn)行批間檢測(cè)，計(jì)算變異系數(shù)（CV）。

特異性與抗干擾性：在10ng/μL FITC-BSA樣品中，分別加入不同濃度的干擾物，檢測(cè)干擾物對(duì)定量結(jié)果的影響，以誤差≤±5%為抗干擾合格標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，對(duì)比博清生物熒光計(jì)與紫外分光光度計(jì)對(duì)含游離FITC的混合樣品的檢測(cè)結(jié)果。

3、實(shí)際樣品檢測(cè)

選取3組經(jīng)熒光標(biāo)記的目標(biāo)蛋白（GFP融合蛋白、Cy3標(biāo)記抗體、Alexa Fluor 647標(biāo)記抗原），分別采用博清生物熒光計(jì)、對(duì)照熒光計(jì)及紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣，比較三種方法的檢測(cè)結(jié)果一致性。

二、結(jié)果與分析

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

博清生物熒光計(jì)對(duì)FITC-BSA的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的二次擬合關(guān)系，回歸方程為 y=0.032x2+5.87x+12.3（R2=0.9992），有效線性范圍為0.1~200ng/μL，覆蓋了大部分熒光標(biāo)記蛋白實(shí)驗(yàn)的常用濃度區(qū)間。檢出限（LOD）為0.05ng/μL，定量限（LOQ）為0.15ng/μL，顯著低于傳統(tǒng)紫外吸收法（LOD≈1 ng/μL），表明該儀器對(duì)低濃度熒光標(biāo)記蛋白具有更高的檢測(cè)靈敏度。

（二）精密度驗(yàn)證

批內(nèi)與批間精密度結(jié)果顯示，低、中、高三個(gè)濃度樣品的批內(nèi)CV分別為1.8%、1.2%、0.9%，批間CV分別為2.9%、2.1%、1.7%，均低于5%的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法的重復(fù)性良好，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。

（三）特異性與抗干擾性

抗干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)NaCl濃度≤300mmol/L、SDS濃度≤0.5%、Triton X-100濃度≤2%時(shí)，博清生物熒光計(jì)的檢測(cè)結(jié)果誤差均≤±3.5%，且對(duì)游離FITC染料（≤5μg/mL）無(wú)明顯響應(yīng)，而紫外分光光度計(jì)在含0.5μg/mL 游離FITC的樣品中檢測(cè)誤差高達(dá)28.7%。這一結(jié)果證實(shí)，博清生物熒光計(jì)通過(guò)特異性熒光染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)，可有效排除游離染料及常見污染物的干擾，檢測(cè)特異性顯著優(yōu)于紫外吸收法。

（四）實(shí)際樣品檢測(cè)對(duì)比

對(duì)3組實(shí)際熒光標(biāo)記蛋白樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，博清生物熒光計(jì)與對(duì)照熒光計(jì)的檢測(cè)值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而紫外分光光度計(jì)的檢測(cè)值普遍偏高（誤差12.3%~27.5%），主要原因是其無(wú)法區(qū)分蛋白結(jié)合熒光與游離熒光。此外，博清生物熒光計(jì)的單次檢測(cè)時(shí)間僅需3~5分鐘，樣品消耗量?jī)H1μL，較對(duì)照系統(tǒng)（樣品量2μL，檢測(cè)時(shí)間5~8分鐘）更具高效性和經(jīng)濟(jì)性。

三、討論

熒光標(biāo)記蛋白的定量分析面臨兩大核心挑戰(zhàn)：低濃度樣品的精準(zhǔn)檢測(cè)與復(fù)雜基質(zhì)中的特異性識(shí)別。本研究建立的博清生物熒光計(jì)檢測(cè)方法，通過(guò)以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)解決了上述問(wèn)題：其一，采用高特異性熒光染料，僅與蛋白質(zhì)結(jié)合后發(fā)射熒光信號(hào)，有效排除游離染料、鹽離子及去污劑等干擾，這與對(duì)照系統(tǒng)的檢測(cè)原理一致，但在抗干擾濃度閾值上更具優(yōu)勢(shì)（如耐受2% Triton X-100，高于對(duì)照系統(tǒng)的1%）；其二，儀器光學(xué)系統(tǒng)的高靈敏度設(shè)計(jì)使檢出限低至0.05ng/μL，滿足了微量珍貴樣品（如免疫沉淀產(chǎn)物、活體組織提取蛋白）的定量需求；其三，簡(jiǎn)化的操作流程（無(wú)需復(fù)雜樣品預(yù)處理，孵育時(shí)間≤3分鐘）及低樣品消耗量（1~20μL），顯著提升了實(shí)驗(yàn)效率并降低了成本。

在實(shí)際應(yīng)用中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備質(zhì)量是影響熒光定量準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。本研究通過(guò)嚴(yán)格控制試劑新鮮度、同批次處理標(biāo)準(zhǔn)品與樣品、確保R2≥0.998等措施，有效降低了系統(tǒng)誤差。此外，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光計(jì)的緊湊型設(shè)計(jì)使其適用于移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)場(chǎng)景，而其兼容多種熒光標(biāo)記（FITC、Cy3、Alexa Fluor 系列等）的特性，進(jìn)一步拓展了應(yīng)用范圍。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法的局限性在于對(duì)高濃度樣品（>200ng/μL）需進(jìn)行稀釋處理，且檢測(cè)結(jié)果依賴于專用試劑盒的特異性。未來(lái)可通過(guò)優(yōu)化染料配方與儀器光學(xué)參數(shù)，進(jìn)一步拓寬線性范圍，并開發(fā)針對(duì)不同修飾類型熒光標(biāo)記蛋白的專用檢測(cè)模塊，以滿足更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)需求。

本研究成功建立了基于博清生物熒光計(jì)的熒光標(biāo)記蛋白定量分析方法，該方法具有線性范圍寬（0.1~200ng/μL）、檢出限低（0.05ng/μL）、精密度高（CV<3.1%）及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可有效排除游離熒光染料及常見污染物的干擾。與傳統(tǒng)紫外吸收法及商用熒光定量系統(tǒng)相比，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光計(jì)在檢測(cè)效率、樣品消耗量及抗干擾能力上更具優(yōu)勢(shì)，適用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究、生物制藥質(zhì)量控制、臨床診斷等多個(gè)領(lǐng)域。該方法的建立為熒光標(biāo)記蛋白的精準(zhǔn)定量提供了新的技術(shù)選擇，具有重要的科研價(jià)值與應(yīng)用前景。